水稻基因靶向敲入效率增高方便育種

本報訊 中國科學院分子植物科學創(chuàng)新中心研究員朱健康團隊采用修飾后的DNA片段作為供體，在水稻上建立了一種片段靶向敲入和替換技術，高達近50%的靶向敲入效率將地方便植物的研究和育種。相關研究成果近日在線發(fā)表于《自然—生物技術》。

此前，CRISPR/Cas介導的植物基因組定點敲除技術只能在基因組特定位點產生隨機插入和刪除，片段插入和替換的效率一直很低，限制了其在植物研究和育種上的應用。因此，迫切需要建立植物基因組片段插入和替換技術體系。

朱健康研究組通過嘗試，發(fā)現將供體片段同時進行硫代修飾和磷酸化修飾后，能增強CRISPR/Cas9引導的靶向敲入效率。研究團隊先后在14個基因位點上成功靶向敲入了各類調控元件，包括翻譯增強子、轉錄調控元件，甚至整個啟動子，供體片段長達2049bp。通過對1393株各類T0代基因編輯水稻植株的分析發(fā)現，該方法的敲入效率可高達47.3%，平均效率為25%。如此高的敲入效率甚至可以同時在四個位點上實現多基因靶向敲入。

研究人員預計，該技術的建立將使靶向敲入成為一項和靶向敲除一樣的常規(guī)實驗，被各個植物研究和育種單位廣泛應用。

同時，研究人員又巧妙地設計了一種片段替換的策略，稱之為重復片段介導的同源重組（TR-HDR）方法。常規(guī)的HDR頻率極其低下，但他們在前期的實驗中發(fā)現，基因組上串聯重復片段間的HDR頻率非常高。他們利用這一現象，通過將修飾的片段靶向敲入目標位點，人為制造這種串聯重復結構，誘導TR-HDR去實現片段替換。采用該技術，他們在五個基因位點上實現了片段替換和原位的Flag標簽蛋白融合，效率高達到了11.4%。這一技術突破將有助于植物學研究，農作物定向遺傳改良的進程。

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